Immunity狼疮样自身免疫性疾病

TasukuHonjo

KyotoUniversity,Japan

摘要：

PD-1是一种含有ITIM抑制性基序的55kd跨膜蛋白，活化的淋巴细胞和单核细胞可被诱导产生这种蛋白。成熟的C57BL/6PD-1-/-同源性小鼠自发发育为狼疮样增生性关节炎、IgG3沉积的肾小球肾炎，这种现象在Fas突变后更加明显。在H-2b/d背景的2C-TCR转基因小鼠中使PD-1缺失后会导致慢性和全身移植物与宿主不相容。CD8+2C-TCR+PD-1-/-的T细胞在对抗H-2d同种异体细胞时会体外增殖加快。总的来说，PD-1作为一个免疫反应的负性调节分子维持了外周自身耐受。

引言：

在不同阶段，不同的免疫活性细胞保持自我耐受。例如在T细胞中的分化过程中，自体反应的T细胞克隆在胸腺中被消除(负选择或中央耐受)。成功逃脱负性选择的T细胞被释放到外周，但这些T细胞仍然受到限制以避免对自身抗原产生反应(即外周耐受)。基于各种动物模型，已经提出了几种不同的外周耐受机制，包括克隆性失能、抗原受体/协同受体复合物的下调和参与主动抑制。类似的，自耐受性机制也被认为在B细胞中起作用。

系统性红斑狼疮(SLE)是人类系统性自身免疫性疾病的原型，以多种多器官损伤为特征，较为明显的是增生性肾小球肾炎和关节炎。几十年来，人类和小鼠狼疮疾病中自身耐受的下调已经产生了许多严重的影响。然而，导致狼疮特征性疾病的确切细胞和分子机制仍不清楚，几十年来，人们广泛地研究了几种自发发生类狼疮疾病的小鼠模型。NZB、MRL/Mp和BXSB小鼠会出现类似狼疮样的晚发疾病，它们具有相似但不同的病谱。NZBxNZWF1、MRL/Mp-lpr/lpr和bxsb/Yaa是通过在上述模型小鼠中引入额外的遗传因子而产生的，它们可以发展出更早发病的侵袭性疾病。最近对这些狼疮易感小鼠的全基因组连锁分析揭示了一些与个别疾病表现相关的基因座，但这些易感基因尚未被确定。

在这种情况下，基因操纵的小鼠模型发展的狼疮类疾病将非常有助于提供深入了解狼疮的发病机制。虽然bcl-2或fli致癌基因的过表达会导致肾小球肾炎发生,但这些转基因小鼠模型可能不适合研究自身免疫性疾病,因为这说明病因机制的发病机理主要是由于淋巴细胞增殖和/或存活表达转基因而不是特定的免疫缺陷的监管。在lyn缺乏的小鼠中也可产生肾小球肾炎而不是关节炎。然而，与自然狼疮易发小鼠和人类SLE患者产生高水平的IgG不同，lyn缺乏小鼠表现出选择性的IgM增加。到目前为止，还没有一个已知的基因被证明与肾小球肾炎和关节炎(系统性自身免疫性疾病的标志)有关。

PD-1基因属于免疫球蛋白基因超家族，编码一个55kDa的I型跨膜蛋白，含有免疫非受体酪氨酸基抑制基序(ITIM,V/IxYxxL)，PD-1结构（包括ITIM在内）在小鼠和人之间是保守的。虽然PD-1仅在正常小鼠胸腺中的一小部分中表达，但在T、B外周血淋巴细胞中均被强烈诱导，因此被归类为活化抗原。pd1缺陷小鼠表现出轻度但一致的脾肿大、对TI-2抗原反应产生选择性IgG3抗体增强。pd-1缺陷小鼠脾脏B细胞在体外抗igm刺激的反应也更强烈。这些结果提示PD-1可能参与了体内某些免疫应答的负调控。近年来，许多具有ITIM基序的受体被报道，其中CD22、FcgRIIB和杀伤细胞抑制受体(KIRs)的研究最为广泛。研究表明，这些蛋白通过ITIM招募酪氨酸磷酸酶如SHP-1和肌醇磷酸酶SHIP，对免疫受体的基于酪氨酸激酶的信号通路起负调节作用。CD22和FcgRIIB缺陷小鼠体内显示出明显的B细胞反应增强。然而，没有报道称这些小鼠出现任何系统性自身免疫性疾病的症状。

在本研究中，我们报道了pd-1缺陷的B6小鼠随着年龄的增长自发地发生了典型的狼疮样肾小球肾炎和破坏性关节炎，这两种现象都被引入lpr/lpr突变显著增强。PD-1缺失的H-2Ld特异性TCR转基因小鼠模型中，会发生移植物抗宿主疾病的自身免疫疾病，并且PD-1作为负性调节分子，体外促进T细胞克隆的增殖对h-2d靶细胞的特异性反应。基于这些结果，我们提出PD-1缺乏引发特异性狼疮样疾病可能是通过体内外周自我耐受的慢性破坏而导致的。

结果：

1.成年B6-PD-1-/-小鼠狼疮样疾病的自发性发展

将PD-1-/-小鼠与B6小鼠(称为B6-PD-1-/-小鼠)回交11代，对其器官进行组织学检查。在6个月大时，10只B6PD-1-/-小鼠中有3只表现出轻度增殖性肾小球肾炎，肾小球受影响程度低于50%(1级)，10只小鼠中有4只表现出关节炎，足关节滑膜组织内膜层增加(1级)。在这个年龄的B6小鼠中，根本没有观察到这种组织学变化。随着C3的沉积，B6PD-1-/-小鼠的肾小球中检测到IgG3的显著沉积，而在B6小鼠的肾小球中，除了IgG2a边缘外，几乎没有发现IgG的沉积(图1)。无论组织学变化如何，在B6和B6-PD-1-/-小鼠的肾小球中都能检测到IgM的沉积。在这个年龄的所有B6-PD-1-/-小鼠中，血清IgG3也都有选择性的显著增加(数据未显示)。

14月龄时，4只B6-PD-1-/-小鼠中有2只表现出典型的2级狼疮样肾小球肾炎，类似于毛细血管内增生性肾小球肾炎，伴有pas阳性物质的沉积(图2B和2C)，而年龄匹配的B6小鼠表现为轻度1级肾小球肾炎(表1;图2a)。组织学改变为2级或2级以上，我们一般认为为明显的病理病变，认为其表现相当显著。而这个结论与年龄原因而产生的变化不同。所有4只B6-PD-1-/-小鼠的足关节表现出关节炎，其中2只表现出2-3级的晚期关节炎病变并伴有广泛的肉芽肿性炎症(图2E和2F)。对照组B6小鼠在相同年龄时从未表现出关节炎的组织学证据(图2D;表1)这些结果表明PD-1基因缺陷导致了B6小鼠发生慢性狼疮样肾小球肾炎和晚发性关节炎。

图1.24-27周龄B6、B6-PD-1-/-、B6-lpr/lpr、B6-lpr/xPD-1-/-、MRL-lpr/lpr小鼠肾脏切片，用山羊抗血清对小鼠IgM、IgG2a、IgG3或补体C3进行免疫组化染色。

图2.B6-PD-1-/-和B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠各种组织的组织学变化

2.lpr突变对B6-PD-1-/-小鼠狼疮样疾病的加速和增强作用

迟发性狼疮MRL小鼠的慢性疾病表现在引入lpr突变后被显著加速。因此我们制备了B6-PD-1-/-xlpr/lpr小鼠，以观察lpr/lpr突变是否同样影响pd-1缺陷小鼠的疾病发展。6个月大时，9只B6lpr/lprxPD-1-/-小鼠中有8只出现了典型的肾小球肾炎(2级)(图2H;表1)，PAS染色显示有广泛的免疫复合物沉积(图2I)，而15只B6lpr/lpr小鼠中只有1只在相同年龄出现2级病变(图2G;表1)。肾的免疫荧光分析再次显示，在B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠肾小球中IgG3沉积占优势，而在B6-lpr/lpr小鼠肾小球中IgG3沉积较少(图1)。与B6lpr/lpr小鼠相比，B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠的肾小球中C3的沉积更为丰富。MRL-lpr/lpr小鼠与之前的报道一致，表现出丰富的IgG亚类肾小球沉积(图1)。

在6个月大的9只B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠中，有6只小鼠的足关节在组织学上显示了严重的关节炎病变(2-3级)(图2K和2L)。在任何年龄匹配的B6-lpr/lpr小鼠中没有观察到关节炎的组织学证据(图2J;表1)。因此，在B6-PD-1-/-小鼠中引入lpr/lpr突变可以加速肾小球肾炎和关节炎的发病和严重程度，其程度与MRL-lpr/lpr小鼠相似(表1)。由于lpr单独突变很难引起B6小鼠的肾小球肾炎和关节炎，但这种突变却加速了PD-1缺陷小鼠的表型。事实上，B6-lpr/lprxPD-1+/-小鼠表现出介于B6-lpr/lpr和B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠之间的中度疾病(表1)，提示PD-1基因可能对狼疮样疾病的发生有剂量效应。

在16周周龄时，B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠比B6-lpr/lpr小鼠、MRL-lpr/lpr小鼠表现出更广泛的淋巴结病变。组织学上，B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠淋巴结中可见异常的有丝分裂灶(图2O)，同时伴有骨髓广泛增生(图2M和2N)。流式细胞术分析显示，B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠淋巴结中“异常”的B+Thy1+T细胞比例较B6-lpr/lpr小鼠显著增加(65.1%vs39.3%)(图3A)，与MRL-lpr/lpr小鼠的淋巴结中“异常”的B+Thy1+T细胞比例相同(65.6%)。总T细胞比例中减去CD4+CD8+T细胞即为CD4-CD8-细胞的比例，在B6-lpr/lpr、B6-lpr/lprxPD-1-/-和MRL-lpr/lpr小鼠中分别为30.9%、60.5%和61.1%。与B6-lpr/lpr小鼠相比，B6-lpr/lprxPD-1-/-小鼠的淋巴结细胞数量要大得多，因此B6-lpr/lpr小鼠PD-1缺失导致的异常T细胞数量增加非常惊人。B+Thy-1+T细胞和CD4-CD8-T细胞之间的差异可以用B+CD4+T细胞来解释，因为在B6-lpr/lpr小鼠中大部分CD4-CD8-T细胞、CD4+T细胞表达PD-1，而CD8+T细胞不表达PD-1。由于B6lpr/lpr小鼠淋巴结中大多数异常T细胞表达其他激活标记物，如CD44和CD69(图3B)，这一结果提示PD-1可能是这些异常T细胞扩增的负调控因子。CD4+CD8+细胞偶尔出现在没有PD-1缺陷的B6-lpr/lpr小鼠中(图3A和3B)，其性质尚不清楚。

图3.流式细胞术分析B6-lpr/lprXPD-1-/-小鼠的淋巴结细胞

3.PD-1缺失时，2C-TCR转基因T细胞在自身反应背景下被激活的证据

由于上述观察结果暗示PD-1缺乏可能导致自身耐受性的慢性破坏，因此我们希望在体内直接检测PD-1缺乏对潜在的自身反应性T细胞的影响。为此，我们采用H-2b/d背景下h-2ld反应的2C-TCR转基因小鼠，其中转基因CD8+T细胞可能具有自身反应性。

将B6-PD-1-/-小鼠与BALB/c小鼠回交2-4代，得到PD-1+/-(H-2d/d)小鼠，再与2CxPD-1-/-(H-2b/b)小鼠杂交，得到2CxPD-1-/-(H-2b/d)小鼠。在69只10周龄2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠中，其中17只濒临或已经死亡，其余小鼠与2CxPD-1+/+小鼠相比，表现出明显的生长迟缓和脾肿大。在69只10周龄小鼠中,其中23只2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠表现出不同程度的皮肤病变,如皮炎病变、坏死病变,红斑,这些皮肤病变伴有炎性细胞渗透到表皮通常出现在移植物抗宿主病(图4a-4c)。许多其他器官，包括心脏(图4E和4F)、肺(图4h和4I)、肝脏(图4J)、唾液腺(图4K)、胰腺(图4L)和肾脏(数据未显示)也被发现密集浸润炎性细胞。免疫组化分析显示，CD8+和2C-TCR+T细胞在2CxPD-1-/-小鼠中浸润表皮基底层(图4N和4P)，而在2CxPD-1+/+小鼠中未浸润(图4M和4O)。所有这些特征都与慢性移植物抗宿主病一致。59只2CxPD-1+/+H-2b/d小鼠均表现健康，无明显疾病迹象。

在2CH-2b/d转基因小鼠中，绝大多数表达2C-TCR的CD4+CD8+胸腺细胞都是在胸腺中阴性选择的，因此之前报道的CD8+T细胞在脾脏中出现的很少(图5A和5B)。PD-1的缺失似乎没有影响负选择，甚至没有加速这一过程(图5A)。与2CH-2b/d小鼠相比,2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠的胸腺细胞的总数减少了三分之一，CD4+CD8+细胞减少的更多,而CD4+CD8-2C-TCR-略受影响。与2CH-2b/d小鼠相比，2CxPD-+/-H-2b/d小鼠脾脏总细胞数明显增加。更值得注意的是，2CH-2b/d小鼠中CD8+T细胞更多，从而导致了系统性移植物抗宿主样疾病。与后者相比，前者的脾脏中确实表达了2C-TCR(图5B和5C)。2CH-2b/d小鼠的CD8+T细胞中有相当一部分表达PD-1，而2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠中没有表达PD-1。我们进一步比较了2CH-2b/d小鼠和2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠脾脏CD81T细胞的表面表型。与2CH-2b/d小鼠相比，2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠中CD45RBlowCD62LlowCD69+群体显著增加(图5C)。CD44的平均表达强度在2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠中较高，而CD25在两种小鼠中均未检测到。这些结果表2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠外周血CD8+T细胞中有相当一部分表现出所谓的“抗原引物”表型。这些结果共同表明在2CxPD-1-/-H-2b/d小鼠的外周中，自反应的CD8+2C-TCR+T细胞有明显的激活和增生。

图4.2CxPD-1-/-(H-2b/d)小鼠10周龄各组织的组织学变化

图5.2CxPD-1+/+和2CXPD-1-/-小鼠H-2b/d自反应状态下胸腺细胞和脾细胞的流式细胞术分析

4.PD-1缺失时CD8+2C-TCR+T细胞对特异性抗原的增殖增强

最后，为了深入了解PD-1在T细胞中作用的分子机制，我们直接比较了PD-1存在和不存在时2C-TCR+T细胞的增殖反应。为此，我们使用了来自B6-2C和B6-2CxPD-1-/-小鼠的脾脏细胞，其中2C-TCR+T细胞被认为是正常阳性选择的，因为H-2b/d背景下的T细胞数量太少，无法直接检测。由于PD-1是一种活化诱导抗原，我们在体外用BALB/C脾细胞预刺激脾脏细胞。体外刺激后，基本上B62C和B6-2CxPD-1-/-小鼠的母细胞均表达CD8，而PD-1仅在B62C小鼠的2C-TCR+T细胞上表达(图6A)。当这些细胞被IL-2或抗CD3单克隆抗体刺激时，2c-TCR1和2C-TCR+PD-1-/-细胞表现出类似的增殖反应，说明PD-1缺失不影响细胞通过TCR或IL-2受体本身的自主增殖。相比之下，与2C-TCR1PD-1+/+T细胞相比，2C-TCR+PD-1-/-T细胞对BALB/C脾细胞(H-2d)的特异性增殖反应明显增强，而对B6脾细胞(H-2b)的特异性增殖反应不明显(图6D)。结果强烈表明，通过特异性抗原呈递细胞的刺激，引物T细胞上的PD-1负调控了TCR介导的增殖反应。

图6.B6-2C和2CXPD-1-/-小鼠2CTCR+CD8+T细胞的增殖反应

王雪彤