外周血淋巴细胞绝对计数在结直肠癌和食管癌

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中华临床实验室管理电子杂志,,7(3):-.DOI:10./cma.j.issn.-..02.

目的

通过回顾性分析结直肠癌和食管癌患者手术前后外周血T淋巴细胞和NK细胞数据，探讨免疫细胞绝对计数对于肿瘤患者疾病监测的临床价值。

方法

回顾性分析我院64例结直肠癌和55例食管癌患者手术前后的外周血T淋巴细胞和NK细胞绝对计数与肿瘤病理结果、肿瘤分期的关系，以及动态变化表达结果。

结果

(1)结直肠癌Ⅰ期到Ⅳ期患者术前外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞计数均逐渐增加，其中仅CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞数目变化具有统计学意义(P0.05)。术后结直肠癌患者各淋巴细胞亚群计数在TNM分期间无显著性差异。

(2)食管癌患者术前各TNM分期间的T淋巴细胞亚群计数未见显著差异(P0.05)；术后食管癌患者CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞计数在Ⅰ期和Ⅲ期均有显著性差异(P0.05)，总体表现为随TNM分期，淋巴细胞计数升高。(3)结直肠癌患者术前外周T淋巴细胞亚群计数具有肿瘤分化程度越高其数目越低的趋势，且伴有淋巴结或远处转移患者的术前T细胞数目增加，NK细胞数目降低，但仅CD3+CD8+T细胞增加有统计学意义(P0.05)；食管癌患者外周T淋巴细胞计数与肿瘤分化程度和肿瘤转移与否均无明显关系。(4)淋巴细胞计数的术前和术后动态分析显示，结直肠癌和食管癌患者外周T细胞亚群和NK细胞数目均表现为术后降低，随后逐渐增高趋势(P0.05)。结论

结直肠癌与食管癌外周各淋巴细胞亚群计数在TNM分期、肿瘤分化程度及肿瘤转移与否间的临床表现不同；结直肠癌患者可能因机体高肿瘤负荷及低分化肿瘤促进机体免疫反应性T细胞亚群增殖，而抑制NK细胞增生；手术创伤可导致肿瘤患者机体的T淋巴细胞和NK细胞一过性降低。

正文机体免疫紊乱及免疫监视效能的降低是导致肿瘤发生发展的重要因素[1]，机体中CD8+T淋巴细胞和NK细胞具有重要的抗肿瘤效应，外周T淋巴细胞亚群及NK细胞的数量可直接反映机体细胞免疫的状况。淋巴细胞亚群之间的细微平衡是维持免疫系统内部环境稳定的一个中心环节，其中NK细胞为非特异性效应细胞，T淋巴细胞为特异性效应细胞，他们共同参与和调节了体内的抗肿瘤免疫过程[2]。CD3+T细胞的数量代表了机体总的细胞免疫状态；CD4+T细胞为辅助性T细胞，辅助机体完成抗肿瘤免疫；CD8+T细胞从细胞毒性和免疫抑制两方面发挥不同的效应作用；CD4+/CD8+T细胞亚群动态平衡维持机体细胞免疫功能的稳定，当其比值降低，则患者的免疫功能低下，从而有利于肿瘤的增殖。NK细胞则是抗原非特异性的细胞群体，其肿瘤杀伤作用无主要组织相容性复合体限制，在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。因此，本研究希望明确免疫细胞计数对于肿瘤患者疾病监测的临床价值。肿瘤的传统治疗方式仍以放疗、化疗或手术等手段为主，而放化疗对机体细胞的非特异性杀伤效应可导致免疫细胞降低，因此为避免放化疗对免疫细胞的影响，本研究中选择了手术治疗且未进行任何放化疗的结直肠癌和食管癌两类肿瘤患者，拟通过回顾性分析这群结直肠癌和食管癌患者手术前后外周血T淋巴细胞和NK细胞计数与肿瘤病理分期、肿瘤进展的关系，以及手术前后淋巴细胞绝对计数动态变化，探讨外周血免疫细胞计数对于手术治疗的肿瘤患者疾病监测的临床价值，以及其在不同部位肿瘤进展的临床应用意义。材料与方法一、研究对象1．结直肠癌组病例来源于年1月至年3月我院住院的结直肠癌患者，符合以下条件：(1)原发性结直肠癌患者首诊，均有术后病理诊断及肿瘤结节转移(tumornodemetastasis，TNM)分期；(2)入院前无手术、放疗、化疗、免疫治疗史；(3)无严重损害免疫功能的疾病如获得性免疫缺陷综合征、系统性红斑狼疮、慢性乙型病毒性肝炎等；(4)近期无明确感染史；(5)未使用胸腺肽等免疫增强剂。64例病人符合上述条件纳入研究，年龄61.00±13.48岁，其中男性43例，女性21例，所有病人入院后均接受手术治疗，术后未采用化疗和放疗等其他方式治疗；所有患者术前经病理诊断明确肿瘤病理类型及分化程度：64例均为腺癌，其中低分化4例，中-低分化22例，中分化38例。根据结直肠癌TNM分期(UICC/AJCC第7版)[3]：Ⅰ期8例，Ⅱ期21例，Ⅲ期25例，Ⅳ期10例。见表1。患者基本信息2．食管癌组病例来源于年1月至年3月我院住院的食管癌患者，均为原发性食管癌首诊，其余纳入条件同结直肠癌组。55例病人符合纳入条件进入该研究，年龄60.38±7.00岁，其中男性42例，女性13例，所有病人入院后均接受手术治疗，术后未采用化疗和放疗等其他方式治疗；所有患者术前经病理诊断明确肿瘤病理类型及分化程度：53例鳞癌，1例腺癌，1例小细胞癌；低分化12例，中-低分化17例，中分化18例，中高分化6例，高分化2例。根据食管癌TNM分期(UICC/AJCC第7版)[4]：Ⅰ期12例，Ⅱ期20例，Ⅲ期23例。见表1。3．所有患者均在入院时及术后不同时点(结直肠癌分别在术后1~3d，4~6d，7~90d，超过90d，食管癌分别在术后0~2d，3~4d，5~6d，7~9d)空腹采集静脉血5ml肝素抗凝，用于检测外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞绝对计数。二、方法1．检测方法及试剂：外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞绝对计数采用流式细胞术分析。应用BDTruecounttube绝对计数管(美国BD公司)和BDTritestCD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP三色荧光标记鼠抗人抗体(克隆号：SK3/SK1/SK7)，BDFastImmune?IgG1-FITC/IgG1-PE/CD3-PerCP三色荧光标记同型对照抗体检测，BDSimultestCD3-FITC/CD16+CD56-PE双色荧光标记鼠抗人抗体(克隆号：SK7/B73.1/MY31)，BDSimultestControlγ1/γ2a(IgG1FITC/IgG2aPE)同型对照抗体(均为美国BD公司)试剂检测。上机前采用氯化铵溶血剂溶解红细胞后分析。采用美国BDFACSCantoII流式细胞仪检测，BDFACSDiva软件分析数据(美国BD公司)。2．检测方案：采用前向散射光(FS)vs.侧向散射光(SS)双参数散点图确定淋巴细胞群，应用同型对照抗体确定检测电压，用于排除荧光标记过程中的非特异性染色，进行适当荧光补偿以防止不同荧光通道之间检测信号的干扰，确定检测方案。应用BDFACSDiva软件分析流式结果，详细记录CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞，及NK细胞(CD3-CD16+CD56+)数目。三、统计学分析采用SPSS22.0统计软件分析数据，所有数据根据相应的分布特征进行描述，符合正态分布数据采用±SD描述，两样本间比较用t检验，3组及以上样本间比较用方差分析，组间两两比较采用LSD法(各组间方差齐)或Tamhane′sT2法(各组间方差不齐)。以P0.05为差异有统计学意义。结果1．结直肠癌和食管癌患者手术前后外周血各淋巴细胞亚群绝对计数与肿瘤TNM分期关系：结直肠患者术前从Ⅰ期至Ⅳ期外周血CD3+、CD3+CD8+T淋巴细胞计数逐渐增加。Ⅲ期的CD3+CD4+T淋巴细胞计数较Ⅱ期明显升高(P0.05)，Ⅳ期CD3+CD4+T淋巴细胞计数较Ⅲ期降低(P0.05)；Ⅰ期、Ⅱ期与Ⅳ期相比，CD3+CD8+T淋巴细胞计数明显减少；Ⅰ期至Ⅳ期CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值和NK细胞数目无明显变化趋势。术后结直肠癌患者各淋巴细胞亚群计数在TNM分期间无显著性差异。食管癌患者术前各TNM分期间的T淋巴细胞亚群计数及CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值未见显著差异(P0.05)；术后食管癌患者CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞计数水平呈逐渐增加趋势，且Ⅲ期均较Ⅰ期明显升高(P0.05)，总体表现为随TNM分期，淋巴细胞绝对计数水平升高；但CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值无明显变化趋势。见图1。

图1

结直肠癌和食管癌患者手术治疗前后外周血T淋巴细胞亚群或NK细胞绝对计数在肿瘤TNM分期的表达分析

2．结直肠癌和食管癌患者手术前外周血各淋巴细胞亚群计数与淋巴结转移、远处转移和肿瘤分化程度的关系：结直肠癌患者术前外周血T淋巴细胞亚群计数随肿瘤分化程度增高其表现为数目降低，但无统计学差异。术前T淋巴细胞计数在有无淋巴结转移与有无远处转移患者间有逐渐升高趋势，表现为淋巴结或远处转移患者计数升高，但仅远处转移的患者CD3+CD8+T淋巴细胞数较无远处转移患者明显增加(P0.01)。CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值和NK细胞计数在不同肿瘤分化程度及淋巴转移与否患者间无明显变化，在肿瘤远处转移患者较无转移患者有降低趋势。食管癌患者术前外周血CD3+、CD3+CD4+T淋巴细胞计数和CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值仅在肿瘤高分化组增高，其他肿瘤分化程度组间无明显变化，仅高分化组CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值较其他各分化组明显增高(P0.05)；有无淋巴结转移患者间的T淋巴细胞亚群计数未见明显变化。见图2。图2结直肠癌和食管癌患者手术治疗前T淋巴细胞亚群或NK细胞绝对计数表达与肿瘤转移和病理类型的关系分析3．结直肠癌和食管癌患者手术前后外周血各淋巴细胞亚群细胞计数分析：结直肠癌患者术后外周血T淋巴细胞亚群计数和NK细胞计数均明显降低，术后1~3d和4~6d的外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞数，及术后7~90d外周血CD3+、CD3+CD8+T细胞数均较治疗前明显降低(P0.05)，NK细胞计数仅术后1~3d较术前明显降低(P0.05)，其他术后时段细胞数与术前差异无统计学意义。术后各时间段组的T淋巴细胞亚群和NK细胞计数均表现为随术后时间延长，其细胞数目逐步增加，但各组间无明显差异(P0.05)。CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值在患者手术前后无明显变化趋势。食管癌患者术后0~2d、3~4d、5~6d的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞计数较术前均显著降低(P0.05)、且在术后6d内随时间延长逐渐降低，但术后6d内的各时段组间细胞计数差异无统计学意义。术后7~9d患者CD3+、CD3+CD4+T淋巴细胞计数较术后3~4d和术后5~6d明显升高(P0.05)，其中位数表达接近参考范围下限。见表2和图3。表2结直肠癌和食管癌患者手术前后外周血各淋巴细胞亚群计数比较(±SD)图3结直肠癌和食管癌患者手术治疗前后T淋巴细胞亚群或NK细胞计数动态表达分析讨论多种基因和细胞正常调节功能的改变导致细胞无限增殖，肿瘤发生。肿瘤部位中专职抗原提呈的细胞摄取肿瘤的抗原后，移行到外周淋巴结，供T、B淋巴细胞识别。激活的T淋巴细胞通过血液到达肿瘤部位发挥攻击和杀伤肿瘤细胞的作用，同时释放肿瘤抗原，增强肿瘤-免疫循环的能力最终消灭肿瘤[2]。抗肿瘤免疫主要以细胞免疫为主，其中最重要的组成成分——T淋巴细胞和NK细胞，他们发挥着杀伤肿瘤和免疫调节的作用。效应T细胞和调节性T细胞比值的平衡则是决定最终免疫反应结局的关键因素。肿瘤患者免疫功能正常与否，直接关系到肿瘤的发生、发展和预后。已有研究发现[5]，乳腺癌患者外周血淋巴细胞比例可客观反映机体的免疫功能状态，对患者术后预后和复发的监测具有重要的意义。但是不可否认外周血淋巴细胞计数能更准确反映机体免疫状态。本研究通过回顾性分析结直肠癌和食管癌患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞计数结果与肿瘤分期、肿瘤分化程度的关系，及其手术治疗前后的变化，探讨外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞计数在评估手术治疗结直肠癌和食管癌患者免疫状态的临床价值，及不同部位肿瘤进展的临床意义。本研究结果表明，结直肠癌和食管癌患者外周血T淋巴细胞和NK细胞数目与TNM分期、肿瘤分化程度和肿瘤转移有着不同的表现趋势，结直肠患者术前从Ⅰ期至Ⅳ期外周血CD3+、CD3+CD8+T淋巴细胞计数逐渐增加，NK细胞计数则表现为逐渐降低趋势，仅个别组间淋巴细胞计数差异有统计学意义；术后结直肠癌患者各淋巴细胞亚群表达在TNM分期间无显著性差异；食管癌患者术前各TNM分期组间T淋巴细胞亚群计数未见显著差异(P0.05)，术后食管癌患者表现为随TNM分期，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞计数逐渐增加(P0.05)。结直肠癌患者术前外周血T淋巴细胞亚群计数随肿瘤分化程度增高表现降低趋势(P0.05)，并在淋巴结或远处转移患者计数升高，但仅远处转移的患者CD3+CD8+T淋巴细胞数明显增加(P0.01)。食管癌患者术前外周血CD3+、CD3+CD4+T淋巴细胞计数和CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值仅在肿瘤高分化组增高，其他肿瘤分化程度组间无明显变化；有无淋巴结转移患者间的T淋巴细胞亚群计数与食管癌患者肿瘤转移无关。我们认为这种不同部位肿瘤间淋巴细胞数目表现在TNM分期、肿瘤分化程度和肿瘤转移情况间的差异性表达可能是与肿瘤本身的特性有关，本研究中的结直肠癌以腺癌为主，食管癌则以鳞癌为主，两种病理类型的分化程度和疾病进展不一样，这种肿瘤组织病理差异及生理结构部位差异带来的机体局部和外周肿瘤免疫差异，继而导致不同外周淋巴细胞数目差异，有研究已发现鳞癌和腺癌的组织局部浸润的淋巴细胞亚群存在差异[6]。同时，由于分析时亚组中样本例数本过少，可能导致一定的结论偏倚，结果2中食管癌不同肿瘤分化组间(除高分化组)外周血T淋巴亚群数目无明显差异，但是由于高分化组例数太少导致该组细胞数目突然性增高，因此，高分化组的结果极可能存在偏倚，需要进一步增加样本量证实。目前对于外周T细胞亚群和NK细胞表达与肿瘤分期的关系的